冷泉港生物科技股份有限公司

冷泉港生物科技股份有限公司冷泉港生物科技股份有限公司成立于上世纪80年代，总部设在台湾。经过20多年的发展，它已经成为一家专业的生命科学仪器代理公司，其代理的产品可以分为5个部分：微生物学仪器、分子生物学仪器、蛋白质组学仪器、生物芯片仪器和常规仪器。在这五部分科研仪器中，大部分是高端的自动化的生命科学仪器。其中，微生物学仪器中，包括培养基的自动制备分装、细菌自动螺旋涂布、自动菌落计数等；另外，其代理的菌种鉴定系统和导电度微生物测定仪是应用范围广泛的，非常具有竞争力和优势的产品。在分子生物学仪器中，既包括了一些自动化的工作站，如自动化细菌挑取系统，干细胞，杂交瘤挑取系统能，也包括了常见的同位素和凝胶检测设备，化学发光和荧光检测仪器等。特别值得一提的是，活体动植物化学发光、荧光影像检测系统。它改变了传统的检测转基因动植物必须杀死动物或破坏植物的常规做法，直接将转基因后的动植物在此设备的暗箱中进行检测，通过CCD就可对转基因的成功与否做出清晰的判定。近几年，蛋白质组学的发展成为生命科学中的研究热点，对蛋白质组学相关仪器的需求也越来越多。冷泉港生物科技股份有限公司代理的蛋白质组学相关仪器主要包括：双激光管激光显微捕获系统(用于获得纯净的组织样品)、全自动双向电泳系统、全自动梯度胶制备系统、蛋白胶影像系统、自动高通量蛋白胶斑点切割系统和蛋白表达纯化工作站。这些自动化的科研仪器都是随着大规模的蛋白质组学计划而诞生的，相信它们会对蛋白质组学的发展起到极大的推动作用。(下转436页)45卷3期2005年6月微生物学报ActaMicrobiologlcaSinicaV01．45No．3June2005三江源地区不同植被土壤固氮微生物的群落结构研究张于光1’2王慧敏1’2李迪强2。肖启明1刘学端1(1湖南农业大学生物安全科技学院长沙)(2中国林业科学院森林生态环境与保护研究所北京)摘要：利用PCR-RFLP和测序分析法对位于青藏高原腹地三江源自然保护区的高寒草甸、高寒草原和高山森林等不同植被类型的土壤固氮微生物的群落组成进行了探讨。经过PCR．RFLP分析固氮基因嘲曰，在3个样品中共得到233个克隆和99个可操作分类单元(0TUs)，NQ．1样地具有最多的克隆数和OTUs，多样性为49．74％，在所有样品中分别具有1。2个明显的优势种群(占总克隆数>15％)，并且具有4个共同的OTUs。选取了26个克隆进行基因测序分析，通过DNAMAN比较表明，这些序列间具有66％．98％的相似性，并且在GenBank数据库中没有发现完全匹配的序列，因此这些序列可能代表着新的固氮生物株系。最后利用ClustalW与Mega软件构建了系统发育树，结果发现，这些序列被分为4个不同的簇，部分序列与属于蛋白细菌(Proteobacteria)的已知细菌具有近的亲缘关系，但是更多的序列与已知细菌具有较远的亲缘关系，而且n归基因序列的分布在样地问没有明显的聚类。关键词：删曰基因，植被类型，群落，PCR．RFLP分析，中图分类号：Q938。Q78文献标识码：A文章编号：0001．6209(2005)03．0420．06生物固氮是氮进入生态系统物质循环的主要途径之一，古细菌、真细菌等多种不同微生物都具有固氮能力…。所有固氮微生物中都含有编码铁蛋白的 n／fH基因，Young等¨1研究发现，n／ftt基因的系统发育与16S rRNA具有显著的一致性，表明n／fH基因是研究固氮生物群落结构很好的标记。目前对 n涮基因的研究主要依赖于非培养的方法，例如PCR克隆、PCR—RFLP、DGGE和荧光标记末端(FLT)一RFLP等，通过这些方法有利于对固氮生物群落进行全面的研究心1。很多研究者应用了这些方法对不同环境中的n／yn基因进行了分析，研究发现在不同植被和地理条件下都存在多样的n／fn基因，例如森林土壤、草地、海底沉积物、耕地等b刈，这些研究中都得到了大量未知固氮生物新的n／fn基因序列，而且某些n归基因具有明显的生态特征b’71，Shaffer等¨。研究认为固氮生物的栖息地与n／fH基因的多样性可能具有相关性。三江源自然保护区位于青海省南部，属于青藏高原腹地，具有独特的自然地理环境。该地区孕育了独特的动植物区系和生态系统，高寒草甸、高寒草原和高山森林是三江源地区重要的植被类型。迄今为止，还未见到关于该地区不同植被的固氮微生物群落结构的报道。本研究旨在利用PCR．RFLP和测序分析，通过对三江源地区不同植被类型土壤的固氮基因(n归)多样性和系统发育进行研究，探讨该地区固氮微生物群落的组成和结构差异。1材料和方法1．1材料1．1．1样品采集：于2003年8月，在青海省三江源自然保护区采集了3个土壤样品，其植被类型分别为高寒草甸、高寒草原和高山森林，样品的具体采集位置、主要植被种类等基本情况见表1。样品采集采用正方形5点取样法，垂直取1—15cm深度的土壤，每个点取样量大体一致，均匀混合后取少量装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室低温保存备用。1．1．2主要试剂和仪器：异硫青酸胍，2一巯基乙醇，Tris．HCI，EDTA，SDS等试剂购自上海生工生物工程公司；DNA回收试剂盒，raqDNA聚合酶购自BioBasicInc．Canda；限制性内切酶MspI和RsaI， pGEM—TEasy载体试剂盒购自PromegaCorp．(USA)；PCR扩增仪为GeneAmpPCR9700。基金项目：国家“十五”科技攻关项目(2001BASl0810)；林业局重点项目“自然保护区社会经济生态价值研究”+通讯作者。Tel／Fax：86-10-；E-mail：reserve@forestry．∽．cn作者筒介：张于光(1976一)，男，湖南湘乡人，博士研究生，主要从事环境微生物分子生态学研究。E-mail：yugzhang@yahoo．eom．cn收稿日期：2004-10-31；修回日期：2005—03．04～3期张于光等：三江源地区不同植被土壤固氮微生物的群落结构研究4211．2样品化学性状的测定哺1应用重铬酸钾法测定c的含量，碱解扩散法测定N的含量，HCIO。一H2so,法测定P的含量，NaOH熔融法测定K的含量。1．3DNA的提取和纯化参照Richard等的方法旧1，并进行了适当修改，具体操作方案参照文献[10]。将溶解的DNA在40V电压下0．8％琼脂糖电泳12h；然后用试剂盒回收。1．4固氮基因(nifH)的PCR扩增和克隆固氮基因的扩增引物参照文献[11]设计，其序列为：n／fit．34F5’．AAAGG(C／T)GG(A／T)ATCGG(C／T)AA(A／G)TCCACCAC．3’；n／fn．491R5’-TrI姗(G，C)GC(G／C)GC(A／G)TACAT(G／C)GCCATCAT一3，该引物可以在不同种属的固氮微生物中扩增到约460bp目标片段¨1|。PCR的反应体系和具体反应条件见文献[10]。利用1．5％琼脂糖电泳PCR扩增产物，试剂盒回收目标片断。根据厂商提供的说明书，用pGEM．TEasy载体试剂盒对回收的目标片断克隆。1．5砌几P分析挑选白斑，用载体pGEM．TEasy特异性引物L—TAATACGACTCACTATAGGGAGA和SP：．CATAC．GArllTAGGrI'GAcAcTATAG对克隆产物进行PCR扩增，经电泳筛选有期望大小片断(有约620bp大小的产物)的克隆。将T7和sP6引物扩增所获得的产物用限制性内切酶MspI和RsaI在37。C酶切3～4h，酶切后用8％非变性聚丙烯酰氨电泳检测，用银染法检测电泳结果¨引。最后用Labwork(3．0．2)软件对染色结果进行数据统计和分析。1．6基因测序和系统发育分析为了进一步弄清n／ftt基因系统发育的多样性，选择部分RFLP谱带出现2次以上的克隆及部分单一克隆进行基因测序，测序由上海生工生物工程公司完成。利用DNAMAN(版本4．0)软件对测序结果进行同源性比较，利用BLAST软件，将测定得到的基因序列与GenBank数据库进行序列比对分析，获取相近典型菌株的n／fH基因序列。然后利用ClustalW(版本1．8)和Mega(版本3．o)中的邻接法(Neigh． bor．Joining)建立n／OH基因的系统发育树，其中地遗传距离用Tamura．Nei公式计算，枝长代表了分歧程度，各枝上的数字是1000次bootstrap重抽样分析的支持百分比。1．7核苷酸序列登录号将测序得到的序列提交GenBank数据库，数据库登录号为AY一AY，AY～AY，AY～AY，AY～。2结果和分析2．1土壤的生物地理化学性状3个样品的部分理化性质见表2。从表1和2可以看出，样地海拔高度相近，土壤酸碱度基本一致，呈中性，含有较为丰富的有机物质，其中N的含量处于0．278％一0．474％，C的含量处于1．780％～8．729％，C含量的变化幅度明显大于N含量的变化。YS．1样地虽然N的含量最高，但是c的含量却最少，因而，C／N比最低，NQ．1样地因具有的c含量最高，C／N比值也最大，ZD．1则居中。同时，土壤P、K等元素的含量丰富，而且K的含量存在较明显差异。表2土壤样品的部分理化性质Table2Physicochemical characteristics of the studied soils2．2 nifH的克隆和RFLP分析从3个样品中共获得233个，稠克隆，通过 l_abwork软件分析酶切结果，共获得99个不同的 n归可操作分类单元(OTUs)(表2)。在各个样地422微生物学报45卷中，都具有不同的明显优势种群，在YS．1样地中具有1个明显的优势种群，该优势种群占总克隆数的27．0％，在ZD一1和NQ一1样地中分别有2个明显的优势种群，分别占总克隆数的36．0％(16．0％和20．0％)和37．9％(15．8％和22．1％)，另外，各个样地中还分别有1～2个不等的次要的优势种群，分别占总克隆数的4．1％～7．9％。同时，在各个样地中，很大部分的OTUs是由单个克隆产生的，也就是说，大多数的克隆分别都具有独特的RFLP谱带类型，在YS一1、ZD一1和NQ．1样地中，由单个克隆形成的OTUs分别占了总OTUs的58．3％、67．9％和61．7％，因此，大部分的OTUs只占了少量的克隆数，这一结果说明各样品中的n归克隆具有高度的多样性。在所有的OTUs中，发现YS．1．10、YS．1—12、YS．1．15和YS．1．19等4个OTUs是3个样地中所共有的，其中YS．1—12在YS一1中是明显的优势种群，占总克隆数的27．0％，YS．1．10在NQ．1中是次要的优势种群，而YS．1．19在YS．1、ZD．1中都是次要的优势种群，YS．1．15则是均是由单克隆产生的OTUs。样地间的两两比较可以发现，更多的克隆是样地间所共有的，具有更多相似的固氮细菌群落。在YS．1和ZD一1样地间共有克隆数和OTUs数分别占总克隆数的14．96％和总OTUs的9．61％，在YS一1和NQ一1样地间共有克隆数和OTUs数分别占总克隆数的10．12％和总OTUs的7．04％，在ZD．1和NQ．1样地问共有克隆数和OTUs数分别占总克隆数的14．7l％和总OTUs的8．00％。2．3 him基因的测序结果和系统发育分析从所有的克隆中挑选出26个克隆进行测序分析。通过DNAMAN软件对所有序列进行了同源性比较，序列相似性为66％～98％。通过GenBank中的BLAST软件，将所有的序列与GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，因此这些序列均是以前没有描述过的固氮基因序列。应用ClustalW和Mega软件将这些序列构建系统进化树(图1)，从系统发育树可以看出，大部分的序列具有高度的多样性，所有的n／fH测序基因被分为4个主要的簇，分属于多个不同的组群，其中大部分都聚集在第一和第三簇中。从图1中可以看出，部分序列与已知的固氮细菌具有近的亲缘关系，这些序列大都聚集在第二簇中。其中来自ZD一1样地的克隆ZD．1．02与属于蛋白细菌(p．Proteobacteria)的杆菌(Burkholderia brasilensis)的相似性为86．2％¨3|，克隆ZD．1．07与属于a．Proteobacteria的根瘤菌(Rhizobium japonicum)具有96．3％的相似性¨4|，克隆ZD．1．08与属于a．Pro． teobacteria的甲烷菌(Methylocella tundrae)聚类在一起，具有90．7％的相似性¨5|。属于NQ．1样地的克隆NQ一1．01与属于a．Proteobacteria的固氮螺菌(Azos． pirillum brasilense)聚类在一起，具有88．4％的相似性，克隆NQ．1．06与属于a—Proteobacteria的根瘤菌(Rhizobiumgallicum)的相似性为85．9％¨6|，克隆NQ．1．07与属于a．Proteobacteria的根瘤菌(Sinorhizobium sp．170)聚类在一起，具有89．6％的相似性¨7|。同时，很大一部分的序列与已知的固氮细菌具有相对较远的亲缘关系，这些序列主要聚集在第三簇和第四簇中，而且除ZD．1(ZD一1．05)样地外，其他样地中的明显优势种群都属于这类序列，分别为YS．1．12和NQ．1．03。在第三簇中来自YS．1样地的5个克隆和属于NQ．1样地的4个克隆与属于8．Pro． teobacteria的脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)和属于8．Proteobacteria的粪产碱菌(A．faecdu)聚集在一起，但是，其相似性相对较低，仅为74．1％～77．5％之间。YS．1．18是唯一属于第四簇中的克隆，与属于13-Proteobacteria的弧菌(Vibrio cincinnatiensisi)聚集在一起，具有的相似性仅为70．7％。另外，在第一簇中，部分序列明显的聚类在一起，但是与已知的固氮细菌不具有明显的亲缘关系。但是这些克隆却与一些未经培养的固氮细菌序列具有较好的同源性，同源性处于85％．95％之间，例如克隆ZD．1．01与微嗜氮的多年生草(Molinia coer． ulea)的根际非培养固氮生物具有90．3％的相似性‘18|。3讨论土壤中仅有1％的微生物已经用于培养，还有相当多的微生物因为无法培养而未被人类所认识，u9|，以PCR为基础的分子生物学方法极大的加快了我们对自然微生物系统的了解汹锄]。为了减少PCR可能产生的人为偏差，我们根据以前的研究结果对PCR方法进行了改良¨“。不同的生态环境因子都可能影响土壤微生物的活性，特别是固氮微生物旧m1，Bardgett等研究认为，植物种类可能容易影响土壤微生物群落的活性汹]。本研究中的样地来自高寒草甸、高寒草原和高山森林3种主要植被，高山森林样地NQ．1具有最多的固氮微生物和丰富的多样性，而高寒草甸和高山森林样地的固氮微生物和多样性更为接近。尽管在3个3期张于光等：三江源地区不同植被土壤固氮微生物的群落结构研究423(AY04051ClusterlCluster2Cluster3] lCluster4J图1根据遗传距离建立的n／／H基因系统发育树Fig．1Phylogenetic and molecular evolutionary analyses of蜩were conducted by genetic distanceThe tree was constructed byNeighbor-Joining procedure in the software ofMega(3．0)．Numbers in pal．entho$eB represent the sequences’accession number inGenbank．The length and bootstrap confidence v8lues of each branch are indicated above忧below the branch。respectively．Bar．5％∞- quenee divergence．样地中仅得到了4个共有的OTUs，但是在以前的研究中发现，相同的高寒草甸植被类型间具有更多的共有克隆和OTUs数¨0I，因此，不同的植被类型下具有不同的固氮微生物群落。Keeling和Limmer等研究表明，土壤的C／N比例影响着土壤固氮微生物的活性㈨驯，同时Cejudo等研究表明土壤中的总N影响固氮生物的分布旧1，本研究中的样地都具有明显不同的C／N比，NQ．1具有最高C／N比值和克隆数，而氮量相对不足，结果显示有自生固氮菌的存在，其在自然状态下固氮效率比根瘤菌高，符合正常生态规律。研究中都得到了大量未知固氮生物新的nifH基因序列，从系统发育树可以看出：(1)大部分的克隆序列与属于Proteobacteria的已知固氮微生物具有424微生物学报45卷近的亲缘关系；(2)n／fn基因序列的分布在样地间没有明显的差异；(3)大多数的n归克隆与已培养的固氮细菌的亲缘关系较远，有的甚至不具有明显的亲缘关系，多数克隆与已知的固氮细菌仅有小于80％的相似性，可能代表了新的固氮细菌序列。如果克隆文库代表了原位的微生物群落结构，那么这些新的组群是否在样地中具有很高的丰度，为了证明丰度，需要应用定量PCR等方法对这些基因进行定量分析。为了更好的理解它们的功能，有必要进行一些分离培养实验。本研究首次对青藏高原地区的固氮微生物群落结构进行了探讨，除提供了固氮微生物的多样性和新的n／fn基因序列外，还就某些影响细菌群落组成的重要生物地理化学性状进行了分析。为了进一步了解固氮细菌群落分布与功能的关系，有必要对固氮细菌群落和它们的动态变化进行更加深入的研究和探讨。[9]RichardAH，Qiu x，WuL，et耐．Simultaneous recovery ofRNA andDNA from soils and 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different plant types，and their biogeochemical parameters were di- verse．DNA was direcdy extracted from the soil microorganism and amplified the n徊gene fragment usingPCR by the primers of n归．34F5’．AAAGG(C／T)GG(A／T)ATCGG(C／T)AA(A／G)TCCACCAC一3’and n／d-／-491R5’-n’GrI．I’(G，C)GC(G／C)GC(A／G)TACAT(G／C)GCCATCAT-3’．For the n／fn gene segment，diversePCR products were character· ized by cloning，restriction fragment length polymorphism(RFLP)analysis and sequencing．A total of233 clones and99 operational taxonomic units(OTUs)which were digested the clones by the restriction enzymesMspI andRsal were ob- rained from all samples．YS．1 had63 clones and24OTUs，ZD．1 had75 clones and28OTUs，andNQ一1 had95 clones and47OTUs，respectively．They were found1—2 significant domain groups of clones and shared4OTUs in all sam— pies．A wide range of sequence divergence was observed in the26，l归clones that were sequenced from all samples．Se- quence comparison showed that the n／fn clones were66％to98％similar．The phylogenetic tree was constructed by theClustalW andMega softwares．26 sequences could be subdivided into4 clusters in the phylogenetic tree，and some of them had the closely similar toProteobacteria，butThe majority of the clones were not closely related to any known culti- rated nitrogen-fixing bacteria，Therefore，most of them are unique and may represent novel sequences of nitrogen-fixing bacteria．Key words：n／fn gene，Plant type，Community，PCR-RFLP analysisFoundation item：The10“FiveYearsKeyPrograms forScience andTechnologyDevelopment ofChina(2001BA510BIO)；TheStateForestryAdministrationKeyProject(Social，Economical andEcologicalValue inNaturalReserve)+Corresponding author．Tel，Fax：86—10-；E—mail：reserve@forestry．ac．cn，yugzhang@yahoo．com．caReceived date：10-31—卷3期2005年6月微生物学报ActaMicrobioiogica$inicaV01．45No．3June2005大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系李宗军(湖南农业大学食品科技学院长沙)摘要：通过对大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间关系研究发现，10℃培养，对数期细胞有最大的压力抗性，随着培养温度的升高直到45℃，压力抗性呈下降的趋势；相反，10T：培养，稳定期的细胞对压力最敏感，随着培养温度的升高，压力抗性呈增加趋势，30—37℃时达到最大，之后到45℃有下降。对数期和稳定期细胞膜脂中不饱和脂肪酸的组成随温度的上升而下降，这与从全细胞中抽提的磷脂的熔点密切相关。因此，对数期细胞压力抗性随着膜流动性的增大而升高；但稳定期细胞，膜流动性与压力抗性之问不存在简单的对应变化关系。关键词：温度，高静压力，脂肪酸，大肠杆菌中图分类号：Q935文献标识码：A文章编号：0001—6209(2005)03一0426-05高压处理对微生物的细胞结构，包括核糖体、核酸、酶、和细胞膜等产生影响，但对微生物的失活机理一直没有完全清楚的认识，通常认为细胞膜的破坏是微生物致死的重要因素之一u。’。压力处理导致细胞膜生理特性的变化，主要表现是ATP和有紫外吸收材料的泄露，以及荧光染料的吸收增加等‘4，引。高压会引起细胞膜的磷脂双分子层中酰基链的铰链，并促进膜脂的凝胶化；膜蛋白也可能出现移位，并发生构象的变化№J。不同温度条件下，微生物细胞膜的脂肪酸组成和膜的状态可能不一样，压力引起的膜的生理变化也存在差异，因此微生物的压力抗性也可能不同。本实验的目的就是研究不同的生长温度下，对数期和稳定期的大肠杆菌细胞膜的脂肪酸组成、膜的流动性和微生物压力抗性之间的关系。1材料和方法1．1材料1．1．1菌株和培养：大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC，购自中国科学院微生物研究所。大肠杆菌在营养肉汤中振荡培养活化后，用稳定期细胞按0．1％(V／V)的接种量，在特定温度下培养，备用。对数期细胞为37℃培养，680nm最适密度OD值为0．2；稳定期细胞为接种后37 oC，18h后的培养物。1．1．2主要试剂和仪器：营养肉汤培养基(购自Sigma公司)，其它化学试剂为分析纯。高压设备，内蒙古包头市五十二所研制，压力范围0～800MPa，压力介质为癸二酸二辛脂；Agilent6820型气相色谱仪，安捷伦科技仪器公司；差示扫描量热仪，美国Perkin．Elmer公司生产DSC一7型。1．2菌落计数细胞悬液被梯度稀释后，以混菌方式准备营养肉汤平板，37℃培养48h。所有实验至少重复两遍。1．3高压处理将微生物全培养物1．5mL加入到2．5cm×2．5cm的塑料管中，热封口后进行压力处理，除实验设计需要外，所有压力处理都在室温下进行(25 oC)。温度补偿由压力斧外的水浴套层进行调节。1．4脂肪酸的提取和分析(10±1)℃、(20±1)℃、(30士1)‘℃、(37±1)oC和(45±1)℃培养的对数期及稳定期的细胞悬液，4。C离心收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液洗涤两遍，冷冻干燥备用。脂肪酸的提取按文献[7]进行。用气相色谱进行分析，条件为：进样口温度：250。C；检测器温度：2600C；载气：氮气；载气流速：1．2mldmin；分流流速：22rnldmin；分流比：20：1；尾吹气：氢气，32mldmin；程序升温：初温80℃，20℃／min升到2100C，再以3℃／min升到225 oC，保持12min。1．5差示扫描■热计分析脂类的物理状态取稳定期细胞培养液500mL，2500 x g，4。C，离心15min收集菌体，用含10mmol／LMgCl2．50mmol／L％s的缓冲液(pH7．5)洗涤两遍。沉淀重新悬浮在作者简介：李宗军(1967一)，男，湖南临湘人，副教授，博士，研究方向是食品微生物与生物技术。Tel：86-731-；Fax：86-731-；E·mall：wngjunelee@yahoo．corn．cn收稿日期：2004—09—27；修回日期：2005．0I．223期李宗军：大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系4277mL上述缓冲溶液中，加入20mL甲醇和lOmL氯仿；连续振荡30min；再加入lOmL氯仿和lOmL缓冲溶液，连续振荡2h。静置，溶液分为两相，收集下层的氯仿层，挥发溶剂。用超声波按lmg／10ptL的比率将样品分散在含有lOmmol／LMgCl2．50mmol／LTris缓冲液(pH7．5)中。取2ttL样品加入到差示扫描量热计的样品盘中，一20℃，30min处理后转入到Perkin．ElmerDifferentialScanningCalorimeter(DSC．7)型量热计中。分析采用10℃／min的温度梯度在一10～60℃的范围内进行，以空白作为对照。2结果和分析2．1生长温度与压力抗性生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响如图1所示。压力抗性以一定时间(Stain)内压力处理前后大肠杆菌菌落数比值的对数表示。10。C培养的大肠杆菌对数期细胞有最大的压力抗性，但随着温度的连续升高直到45℃，对数期细胞的压力抗性呈下降的趋势(图1．A)；相反，10℃培养的稳定期细胞对压力最敏感，随着培养温度的上升，大肠杆菌的压力抗性增大，到30。C和37℃时达到最大值，到45℃时，压力抗性下降(图1-B)。同时，微生物的压力抗性也可以用一定压力下，不同处理时间内大肠杆菌的存活率来描述(图2)。大肠杆菌压力失活动力学一般不呈线性关系，初步的结论是大肠杆菌对数期细胞与稳定期细胞具有不同的压力抗性。0 looPressure(MPa)0Pressure(MPa)图1生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响Fig．1Effect of growth temperature on pressure resistance ofE．coliE．coli were grown atIO。C(◆)，20℃(▲)，30℃(口)，37℃(△)，45℃(◇)to exponential phase(A)or stationary phase(B)and treated for5min at different pressures．Ni：Number of ceHs after treatment；NO：Ini- tial number of cells．一5耄：善2莹·O一8一差6善4黾2 j t／min t／min图2生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响Fig．2Effect of growth temperature on pressure resistance ofE．coli．E．coliWere grown at10。C(◆)，20。C(▲)，30。C(口)，37。C(△)，45。C(◇)to exponential ph8∞and treated at200MPa(A)or to stationary ohase and treated at400MPa(B)．Ni：Number of ceHs after treatment；NO：Initial number of ceils．2．2生长温度对细胞膜脂肪酸组成的影响在对数期和稳定期的细胞中，随着生长温度的升高，细胞膜中饱和脂肪酸的比例增加，不饱和脂肪酸的比例下降(表1，表2)。稳定期细胞中不饱和脂肪酸的含量下降，而环丙烷型脂肪酸的含量增加，在30℃培养的稳定期细胞中达到最高水平为29．4％。流动指数(FluidityIndex，FI)以不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值来计算。在计算流动指数时将短链脂肪酸排除在外，因为研究发现这些脂肪酸主要存在与细胞膜外层的脂类中，对细胞膜的流动性影响不大。虽然对数期细胞的细胞膜的流动指数高于稳定期，但两个时期的流动指数与生长温度之间呈线性负相关(图3)，回归方程分别是：对数期，FI=一0．068·Tg+4．06(群=0．987)；稳定期，FI=一0．068·Tg+3．60(R2=0．966)，Tg为生长温度。表1不同生长温度下对数期大肠杆菌细胞膜脂肪酸组成Table1Fatty acid composition of exponential phase ceUs ofE．coli grown at different temperatures8642O一一P_吾。)一冬。z警一一rIE＼nJ。)一N／oz∞oJ428微生物学报45卷续表18：UFA(unsaturated fatty acid)，total of16：1 and18：1；b：SFA(saturated fatty acid)，total of16：O and18：O；c：CFA(cyclopropone fatty acid)；d：FI(fluidity index)，viz．(UFA+CFA)／SFA；e：SCFA(short-chain fatty ac— id)。total of12：O and14：0．表2不同生长温度下稳定期大肠杆菌细胞膜脂肪酸组成Table2Fatty acid composition of smfionary phase cells ofE．coli grown at different temperatures a：UFA(unsaturated fatty acid)，total of16：1 and18：1；b：SFA(saturated fatty acid)，total of16：0 and18：0；C：CFA(cyclopropone fatty acid)；d：FI(fluidity index)，viz．(UFA+CFA)／SFA；e：SCFA(short．chain fatty acid)， total of12：0 and14：0．2．3膜的流动性与压力抗性之间的关系为了明晰大肠杆菌生长温度、流动性指数和膜图3生长温度与对数期、稳定期细胞膜流动性指数的回归直线Fig．3Relationship between$rowql temperature and the membraneFI of exponential pha8e(●)or smfionary phase(o)脂溶解特性之问的关系，从不同培养温度条件下的稳定期细胞中提取总磷脂，并用差示扫描量热法对磷脂的相变特性进行分析，该技术可以测定样品物理状态发生变化时吸收或释放的能量。差示扫描量热分析结果显示：在热能图中出现了2个宽的不对称峰(图4)，0℃对应的峰与冰的溶解相关；另一个峰则与磷脂的相变有关，最高峰对应的温度即为磷脂的熔点(r。)；对称峰对应的是磷脂的相变温度，此时磷脂中含有50％的液晶态。峰下对应的面积即为磷脂熔化所需的能量，能量的大小受相变分子的数量、分子的同质性及水化程度的影响；经测定熔点温度与生长温度呈正相关，与流动性指数呈负相关(表3)。┏━━━┳━┳━━━┳━┳━━━━┳━━━━┓┃┃L┃A┃┃┃┃┃┃┃．／┃1┃┃┃┃／。┃┃┃┃、、一┃┃┃┃┃┃┃┃、～～┃┗━━━┻━┻━━━┻━┻━━━━┻━━━━┛1刀℃┏━┳━━┳━━┳━━━━━┳━━┳━━┓┃J┃L┃B┃┃．}┃一┃┃┃┃┃．_-I，。┃┃┃┃┃┃’U┃┃┃┃┗━┻━━┻━━┻━━━━━┻━━┻━━┛ lOⅣ℃图4全细胞脂类提取物的差示扫描量热测定图谱Fig．4DSC graph for lipids extracted from whole ceHs cells grown at20℃(A)or37。C(B)to exponential phase裹3稳定期细胞中磷脂的熔点温度、流动性指数与生长温度之间的关系Table3Relationship among phase transition temperature(氏)of phospholipids，FI and grown temperature≥III～良8口m≥Ⅲ，，c宕JQ口岫3期李宗军：大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系429假设在一定温度下，膜的流动性与磷脂的熔点线性相关，如熔点越低，膜的流动性越大；那么对数期细胞中膜的流动性越大，压力抗性越强；而稳定期细胞则具有更为复杂的关系，生长温度在10～37℃之间，膜的流动性与细胞压力抗性间是负相关关系，即细胞膜的刚性越大，压力抗性越强，生长温度在45℃，这种趋势刚好相反，即膜的刚性增加，压力抗，性下降。3讨论3．1生长温度对细胞膜脂肪酸组成的影响大肠杆菌生长在不同的温度条件下，细胞膜的脂肪酸组成是不一样的，随着生长温度的降低，细胞膜中不饱和脂肪酸的含量增加，而饱和脂肪酸的含量下降，这与有关文献的报道一致怫。引。不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸的熔点低，不饱和脂肪酸含量增加会导致细胞膜相变温度的下降，生长温度的不同引起的细胞膜脂肪酸组成的变化，是微生物生命活动对膜流动性的要求。不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率可以间接反映细胞膜的流动性…·。在实验温度范围内，微生物的生长温度与膜的流动性指数呈线性相关，证明不同生长温度下微生物有自适应能力，也说明用实验中定义的流动性指数来指示膜的流动性是可行的。3．2生长温度对压力抗性的影响生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响，对数期和稳定期细胞具有不同的表现。对数期细胞，随着-生长温度的升高，压力抗性下降，这与文献[12]的结果一致，即10℃培养条件下植物乳杆菌对数期细胞的压力抗性大于30。C培养的对数期细胞；但稳定期细胞的压力抗性在30℃，37℃时达到最高，之后有所下降，这种结果在以前的文献中还未见报道。稳定期细胞比对数期细胞有更高的压力抗性。对数期与稳定期细胞对压力抗性的不同取决于生长温度的变化。在大肠杆菌的最适生长温度(370C)下，两者的压力抗性差异最大，而在lO℃的生长条件下，对数期与稳定期细胞的压力抗性差异较小，这．可能与低温下稳定期内没有诱导形成相同特征的细胞有关。3．3细胞膜流动性与压力抗性的关系以大肠杆菌脂肪酸营养缺陷型菌株为材料，就膜流动性对压力抗性的影响研究发现：37cc培养条件下，生长在棕榈酸中的对数期细胞的压力抗性低．于生长在油酸或亚油酸中的细胞，这说明微生物的压力抗性随着细胞膜流动性的增加而增强；而在稳定期，细胞的压力抗性差异较小，其中的原因不太清楚。为什么细胞膜的流动性越大，压力对其的破坏越小?其机理有待进一步研究。压力可以引起磷脂间烃链相互靠近，类似于低温对磷脂分子的影响¨引。细胞膜的流动性越大，压力引发其相变的几率越高，这意味着压力影响了膜脂的相变特征，并进而影响了细胞膜的损伤。通过降低温度使微生物细胞膜磷脂发生相变，对微生物而言不是致命的，但快速降温会导致对数期微生物细胞的死亡，而对稳定期细胞的影响不大。缓慢降温会导致细胞膜磷脂与蛋白质的分离，出现凝胶，并引起细胞内物质的泄漏。膜流动性的变化会对位于膜上的酶活性(如ATPase)、细胞内外的物质交换和细胞膜上蛋白质的构象、定位产生影响，从而导致微生物的死亡。3．4稳定期细胞的压力抗性虽然细胞膜的流动性对微生物的压力抗性有作用，但稳定期细胞自身生理特性等深层次的变化对压力抗性的影响更大。大多数的微生物进入到稳定期或处于饥饿状态时，都会伴随着结构和生理特性的改变，并对热休克、氧化、渗透压、酸等外界胁迫的抗性增强。在大肠杆菌中，这些变化诱导着50多个基因的表达，它们大多数是由选择性的d因子进行调控的，它对提高大肠杆菌0157的压力抗性发挥了重要作用，此外还涉及到通用胁迫蛋白(Universal stress protein，UspA)等其它调控单元u“。通过显微镜观察蛋黄卵磷脂微囊在高压处理过程中的变化发现：加压时，磷脂囊的体积缩小，呈球状；撤除外界压力，囊球破裂，双分子膜消失。但内含胆固醇的材料中，可以减少加压过程中的体积变化，防止减压后囊球的破裂。如果类似的情况也发生在微生物的细胞膜上，那么细胞膜的脂肪酸构成会影响到微生物的压力抗性。在大肠杆菌中没有发现胆固醇，但其他的因素会影响到膜的压力效应。进入对数期后，大肠杆菌的细胞膜和细胞包膜会发生一些变化，包括不饱和脂肪酸转化成它们的环丙烷型衍生物；肽聚糖层增厚；肽．脂蛋白铰链度升高和膜蛋白的铰链。由于在30℃和37℃培养条件下，细胞膜中环丙烷型脂肪酸与压力抗性都处于最大值，Peter¨5。证明环丙烷型脂肪酸对提高稳定期细胞的压力抗性发挥了重要作用。4结论微生物的生长温度、细胞膜的脂肪酸构成及微430微生物学报45卷——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一-生物所处的生长时期都会对微生物的压力抗性产生[7]BlighEG，DyerWJ．A rapid method of total lipid extraction and影响。大肠杆菌对数期细胞的压力抗性随着培养温…?血&撕“如“?B测胁脚鼍，1959，37州1-917·度的升高呈下降的趋势。而稳定期的细胞随着培养li：。a prop。ed。二。。。h0。。for。h二。i。du。ed by。tll。ol，温度的升高，压力抗性呈增加趋势，30．37℃时达到 chaotropic agents，and a reduction of growth temperature．JBacter／．最大，之后到45 oc有T降。对数期细胞的压力抗性，，。2’1982，1∞：166—172_随着膜流动性的增大而升高；但稳定期细胞，膜流动 f8ttvI。id。i。乙出枞缸枷．JB耐施，19“，掰：12磊一1267．性与压力抗性之间不存在简单的对应变化关系。微[10]McGarrityJT，ArmstrongB．The effcct of temperature and other生物在不同生理时期对压力胁迫的应急反应不完全鲫讪。ondit．ion．s。“the蛐．：c泔，。：”州n“d西触蒯‘‘ t一样，这可以在分子水平上得到体现。[11]Del哪EF，Yayan。8AA．Adaptati。of the membrane lipids of a deep-sea bacterium to changes in hydrostatic pressure．Scicnce，参考文献1985．2勰：1lo卜1102．[12]SchechterE，Gulik．KcwlcklT，KabackHR．Correlations between[1]Fark船DF，H007。‘DG·Hish press“re proceesing·J删Sc／， flu。m∞ence x．r州diffracti∞and physiolosical properfi郫in cvto．，、2叭suppl’47．叫’plasndc础二isohted from妣批蒯．B删m砒赢 l2JCheflelJ．Review：high．pressure，microbial inactivation and food1。Dreservation．FoodSciTechnol，m，1995,1：75—90．Acta1972,274：466—477·[3]SmeltJP．Recenl adv∞ces in the micmbiol。盱ofhigll胛sure pn[13]SteegPF，HellemonsJC’KokAE·Synergistic actions of nisin· ce∞ing．TrendsFoodSciTechn01．1998，9：152—158． sublethal high pressure，and reduced temperature on bacteria and ye。[4]Be血oA，ventomG，ca88deiMA，甜02．variati仰in嘲istance ast．ApplEtwironMicrobiol，1999·硒：4148—4154． of natural isolates ofEacherichia coli0157 to high hydrostatic pm．[14]RobeyM，BenitoA，HutsonRH，d a／．Variation in resistance to8Ⅲe，mild heat，∞d other stre∞e8．ApplEnvironMicrobiol，1999，high hydrostatic pressure and rpoS heterogeneity in natural isolates of、65：1564—1569．Eacherichia coli0157：H7．ApplEnvironMicrobiol，2001，研：4901[5]PaganR，MackeyBM．Relationship between membrane damage and一4907． cell death in pressure。treatedEscherichia coli cells：differences be一[15]PeterKJ．Correlation of fatty acid composition with pressure resis- tween exponential and stationary—phase cells and variation among tallee ofE．coli．Canada铆f涮Microbiology，2004，112：104一 strains·ApplEnvironMicrobiol，2000，65：2829—2834．109．一[6]RitzM，FreuletM，OrangeN，et a／．Effects of high pressure on membrane proteins ofSa／monel／a typhimurium．Int，FoodMicrobi—01．2000．55：115—119．Relationship among growth temperature，membrane faUy acid composition and pressure resistance ofEscherichia coliLIZong-jun。(College ofFoodScience andTechnology，HunanAgricu]tureUn／vers／ty，Changsha，Ch／na)Abstract：The relationship among growth temperature，membrane fatty acid composition and pressure resistance ofEs． cherichia coli was studied．Results indicated that the pressure resistance of exponential。phase cell was maximal in cell growth atIO。C and decreased with increasing growth temperatures up to45 oC．By contrast．tlIe pressure resistance of stationary—phase cell was lowest in cell growth atIO。C and increased with increasing growth temperature，reaching a max． imum at30 to37℃before decreasing at45 oC．The proportion of unsaturated fatty acids in the membrane lipids de． creased with increasing growth temperature in both exponential-·and stationary··phase cell and correlated closely with the mehing point of the phospholipids extracted from whole cells．Therefore，pressure resistance in exponential—phase cell in． creased with greater membrane fluidity，whcreas in stationary·phase cell，there was apparently no simple relationship be． tween membrane fluidity and pressure resistance．Key words：Temperature，HighHydrostaticPressure，FattyAcid，Escherichia coli’Corresponding author．Tel：86—731-；Fax：86-731-；E-mail：wngianlee@yahoo．corn．enReceived date：27．09．卷3期2005年6月微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaV01．45No．3June2005葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究靳嘉巍1张力1查锡良1*李华林2瞿涤2(复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系1卫生部糖复合物重点实验室2教育部医学分子病毒学重点实验室上海)摘要：生物被膜(Biofilm)是条件致病菌表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的主要致病因素，生物被膜的形成依赖多糖PIA合成，合成PIA的糖基转移酶由icoADBC基因编码。以生物被膜形成能力不同的菌株为对象，通过研究不同环境对生物被膜形成、细菌总糖量及相关基因表达的变化，探索外界环境对生物被膜形成的影响及葡萄糖对生物被膜诱导的分子机制。有利于生物被膜形成培养条件促进生物被膜形成及多糖的表达，葡萄糖能诱导泐基因的表达和生物被膜形成，ica基因的反义寡核苷酸(ODN)能对抗葡萄糖的作用；葡萄糖作用下不同生长周期生物被膜形成相关基因ica、icaR、AtlE表达不同。表皮葡萄球菌生物被膜的形成与细菌糖代谢有关，葡萄糖通过上调泐表达诱导生物膜形成，但不需要沁基因的持续表达；葡萄糖的诱导作用不是直接通过调节AtlE和icaR基因来实现的。关键词：表皮葡萄球菌，生物被膜，多聚p1，6．2脱氧．2．氨基．D．毗喃葡萄糖(PIA)，反义寡核苷酸(ODN)，ica，AtlE中图分类号：Q93。Q75文献标识码：A文章编号：0001．6209(2005)03一043l-06表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是血浆凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)，一般附着在皮肤和粘膜表面，是常见的条件致病茵。近10年来表皮葡萄球菌的感染率不断上升，特别是在新生儿和免疫力低下的人群中，现已成为医院重要的感染病原菌之一，而且感染范围广，包括心血管、眼耳鼻喉等的感染，甚至引起败血症而导致病人死亡，因此已引起人们的高度重视¨’2-。虽然表皮葡萄球菌分泌的毒性因子较金黄色葡萄球菌少，例如一些破坏组织的蛋白酶，但导致表皮葡萄球菌感染的主要原因在于它粘附在临床上常用的多聚材料上，并形成生物被膜；生物被膜使表皮葡萄球菌感染呈现慢性、持续性和反复性的特点。生物被膜的主要成份为多糖，还包括一些相关的蛋白质，形成生物被膜的多糖主要为线性B．1，6-2脱氧．2一氨基．D．吡喃葡萄糖的多聚物(Polysaeeharide inter． cellular adhesion，PIA)b1。表皮葡萄球菌多糖的合成在生物被膜形成中扮演重要角色，而ica(Intereellu．1ar adhesion)基因是编码多糖合成的糖基转移酶，生物被膜的形成依赖／ca基因的表达和PIA的合成。条件致病菌表皮葡萄球菌生物被膜的形成与外界环境密切相关，环境因素通过调节生物被膜形成相关基因iea，AtlE等的表达影响生物被膜的形成的表型，所以研究环境特别是葡萄糖对表皮葡萄球菌的生物被膜影响及其分子机制十分重要心]。1材料和方法1．1材料1．1．1菌株：实验中采用两株表皮葡萄球菌：97．337株和ATCC．。97．337株从表皮葡萄球菌引起的败血症死亡的病人血中分离得到，鉴定为高生物被膜形成的表皮葡萄球菌(结果未发表)；ATCC．株为ATCC的标准菌株，经鉴定为低生物被膜形成的表皮葡萄球菌。1．1．2培养条件：细菌培养基为TSB(without du． cose)；TSB；LB(添加不同浓度的葡萄糖，分析纯)；LBA¨]。除特别说明外所有细菌培养均在370C有氧条件下培养。1．1．3主要试剂：TSB、TSB(without glucose)、溶菌酶、蛋白酶K均购自Sigma公司，YeastExtract，Tryp． tone购自OXOID公司，TRIzol试剂购自Invitrogen公司，逆转录酶AMV和随机引物购自Promega公司。基金项目：国家“863计划”(2001AA)‘通讯作者。Tel：86．21—；E—mail：xlzha@shmu．edu．ca作者简介：靳嘉巍(1977一)，男，云南人，硕士研究生，从事分子生物学研究。E-mail：jwjin@shmu．edu．cn收稿日期：2004．10—08。修回日期：2005一01．”432微生物学报45卷1．2生物被膜形成测定37℃过夜振摇培养的表皮葡萄球菌1：200接种于96孔板中，37℃无振摇培养24h后，按文献∞1测定生物膜。1．3表皮葡萄球菌的厌氧培养将振摇培养过夜的表皮葡萄球菌1：100接种于96孔培养板中，将96孔培养板放人充满氮气的培养装置中37℃培养24h后用于细菌粘附测定¨’6。。1．4细菌总糖和总蛋白抽提和定量用SDS碱裂解法提取细菌总蛋白H1。蛋白定量采用Lowary法¨]。用硫酸苯酚法测定细菌总糖∽1。1．5菌体基因组DNA提取37℃振摇培养过夜的表皮葡萄球菌，按文献[4，8]提取基因组DNA。1．6／ca基因检测按文献[9]中的PCR方法检测表皮葡萄球菌iea基因。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。1．7菌体总RNA抽提离心收集不同条件下培养的表皮葡萄球菌后，用TRIzol重悬菌体，加入专用的研磨剂后高速振摇，以后的RNA提取按Invitrogen提供的关于TRIzol试剂的使用方法操作n…。为分析不同浓度的葡萄糖对基因icaAB的影响，分别收集培养皿中培养6h和24h的细菌，用于抽提RNA和RT．PCR。为分析在不同的生长期葡萄糖对泌。基因表达的影响，收集3h、6h、10h、16h培养皿中的细菌用于抽提RNA和RT．PCR。为分析葡萄糖作用不同时间对生物被膜相关基因的影响，在不同的时间点加入葡萄糖，然后收集24h后的培养皿中的细菌用于抽提RNA和RT—PCR…。1．8基因mRNA水平测定应用RT-PCR方法检测ica基因mRNA水平。用逆转录酶AMV和随机引物并按照公司提供的操作手册将表皮葡萄球菌的RNA逆转录为cDNA，以PCR检测相关基因，所用引物为：ieaAB—F5’．，IfllAT。CAATGCCGCAGTYGTC一3’．icaAB—R5’-T13"GCrITCTGT-GATACGGqqW,-3；icaR—F5'-CTCGAA3TI'GTI'ACATACTAG．3’，icaR—R5’一TYGGATAGAAAAGTAAAAAG-3’；AtlE—F5’．CAACTGCTCAACCGAGAACA一3’．AtlE．R5’．T1TGTAGATGTYGTGCCCCA-3’：16S rRNA．F5’-ACT—CAAAGGAATrGACGGGG一3’．16S rHNA．R5’．AGAC．CCGGGAACGTATICAC．3’。PCR的反应体系为50／tL，反应条件：940C5min；940C1min55℃1min72℃lmin20个循环；72℃ lOmin[9]，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。1．9设计抑制／ca基因表达的反义寡核苷酸抑制生物被膜形成根据／caA基因的序列(U)设计反以寡核昔酸，并在细菌基因组中进行Blast，找到两段特异性较高的序列：sensel．17：ATGCATGTATITAAC'ITI'； sense60．79：CTGGATAGTAGGATCGATrr，对两段序列进行二级结构分析显示无很稳定的二级结构，根据以上序列合成全硫代反义寡核苷酸：antil．17和an． ti60．79。在含有不同浓度的反义寡核苷酸的培养基中作用不同时间，测定在不同浓度中作用不同时间的生物被膜的产生情况¨3|。2结呆2．1两株表皮葡萄球菌生物被膜形成能力的比较从病人身上分离得到的菌株97．337株为高生物被膜形成的菌株，而ATCC的标准菌株生物被膜形成能力较之为低，几乎没有生物被膜形成。2．2不同培养条件下两株表皮葡萄球菌总糖量的比较上述结果提示两株表皮葡萄球菌的生物被膜形成的能力不同，而生物被膜的主要成份为多糖，为了观察生物被膜形成高低与细菌总糖的关系，进行总糖量的比较。分别在有利于生物被膜形成的塑料培养皿中粘附性培养和不利于生物被膜形成的振摇培养；因为随细菌生长蛋白质的变化不大故可作为细菌量的参数，通过检测细菌总糖量和总蛋白质量的比率来反映细菌总糖的变化，结果发现在有利于生物被膜形成的条件下高生物被膜形成的97．337株总糖量明显高于低生物被膜形成的ATCC．株，但在悬浮振摇培养条件下两株细菌的总糖量没有明显的差别，说明生物被膜形成强时，其总糖量也增加。表皮葡萄球菌生物被膜形成与其糖密切相关，进一步考察通过加入外源葡萄糖影响细菌糖代谢后对生物被膜形成变化的影响。2．3外源葡萄糖对两株细菌生物被膜形成能力的影响培养基中添加的葡萄糖诱导了表皮葡萄球菌97．337生物被膜的形成，而且随葡萄糖浓度的增加0．125％一1％，对生物被膜形成的影响不同。葡萄糖对97．337生物被膜的形成有较强的诱导作用，在添加0．25％的葡萄糖时表皮葡萄球菌的生物被膜形成能力最强，为没有添加葡萄糖的30倍；当葡萄糖浓度进一步增加(大于0．5％)其诱导生物被膜形3期靳嘉巍等：葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究433成能力反而下降而葡萄糖浓度变化对ATCC．的生物被膜形成无明显影响。2．4厌氧环境对两株细菌生物被膜形成的影响通常厌氧环境对细菌能量代谢有很大的影响，特别是降低葡萄糖的有氧氧化后；为进一步证明葡萄糖对生物被膜的诱导作用，考察在增加细菌对糖需求的厌氧环境下葡萄糖对生物被膜诱导作用的变化。研究发现在厌氧环境中表皮葡萄球菌ATCC．生物被膜的形成不受影响。厌氧环境对97—337株的生物被膜的形成有诱导作用，不同的葡萄糖浓度对97—337的粘附能力的诱导也与有氧环境不同，在低浓度葡萄糖下影响较为明显，增加了97—337株生物被膜形成对葡萄糖作用的敏感度(图1)。UUU5U125U25U5U．751Glucose％图1在厌氯环境中葡萄糖对两珠表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响．在有氯和厌氯条件下表皮葡萄球菌97-337粘附与细菌生长的比例Fig1The ratio of biofilm to growth in anaerobic environment in aerobic and anaerobic respectively in the media with different slaco$e concentra- tion2．5两株表皮葡萄球菌生物被膜形成相关基因的比较研究两株生物被膜的表型上的差异是否与生物被膜形成相关基因／ca有关，通过设计一对引物用PCR方法合成跨icaA和icaB的一段序列检测两株表皮葡萄球菌基因组恐。基因旧。。在生物被膜形成能力低下的ATCC一株基因组DNA中没有检测到／caA基因，说明／caA基因缺失或突变；在高生物被膜形成的97—337株基因组DNA中能检测到／caA的存在。2．6葡萄糖对表皮葡萄球菌97．337 ieaAB基因表达的影响葡萄糖能诱导生物被膜的形成，而且两株细菌生物被膜表型的差异与／ca基因有关，为进一步考察葡萄糖对生物被膜的影响是否通过泐基因，用 lit．PCR的方法检测97．337株在不同葡萄糖浓度的生长条件下6h和24h／caAB基因mRNA表达水平旧J。结果发现在添加葡萄糖培养基中生长的97．337表皮葡萄球菌6h时把Ⅱ基因mRNA水平明显高于未添加葡萄糖培养基生长的表皮葡萄球菌，葡萄糖对／ca基因的表达与生物被膜形成的影响一致；但作用24h后／ca基因mRNA水平明显与葡萄糖短时作用6h不同，表明／caAB的表达与生物被膜的形成直接相关。(图2) fAl5075 lGlucose／％16SrRNA(B) lcaAB图2用RT-PCR检测葡萄糖对表皮葡萄球菌97．337／eaAB基因表达的影响Fig．2Different levels of tIm∞ripnon of inS．ep／derm／d／s97—337 cul- lured in the media with different出uc0∞eoneentratlortA：The／caAB transcfiptlon level inS．ep／derm／d／s97—337 cultured for6h；B：The／coAB trar目orip6∞levd inS．呼庇幻碱97—337 cultured for24h．2．7反义寡核苷酸对生物被膜形成的作用多糖PIA是生物被膜形成的关键因素之一，为抑制生物被膜的形成和进一步说明葡萄糖对生物被膜的诱导作用是通过／ca基因，选取参与多糖合成的icaA基因的下列两段序列，并参照这些序列合成的反义寡核苷酸：antil．17和anti60．79，以研究不同浓度的反义寡核苷酸对高生物被膜形成的表皮葡萄球菌97．337株作用不同时间后生物被膜形成的变化。作用位点在icaA起始密码子附近的antil—17对生物被膜形成的抑制效果不很明显，抑制率在25．6％～14．4％之间，在短时处理时对生物被膜的形成有抑制，而长时间处理时没有效果；但是ODN图3反义寡核苷酸对97．337株生物被膜形成的影响Fig．3The biofilm formatted byS．epidermidis97-337 in the media withODN antil一170O0O0O lI；20、EIIJ01日微生物学报45卷 antil．17能够明显对抗葡萄糖对生物被膜的诱导作用，抑制百分率在69％～21％，随着ODN浓度增大效果越明显(图3)。离起始密码子较远的anti60．79对生物被膜形成的抑制效果不明显，在16h平均抑制百分率为6％，只能微弱对抗葡萄糖对生物被膜形成的诱导作用，平均抑制百分率为10％。2．8表皮葡萄球菌在添加葡萄糖的TSB培养基中不同生长期／eaAB基因的mRNA通过生长试验我们可知生长early—exponential为3—4h，mid-exponential为5～6h，post．exponential为9～lOh，stationary为16h。葡萄糖对ica基因的诱导作用只在early．exponential和mid—exponential期，而在细菌生长的stationary期葡萄糖作用下恐。基因的表达量降低，但是葡萄糖作用24h后明显诱导生物被膜的形成，表明／ca基因的表达与生物被膜的形成直接相关但是并不需要持续表达(图4)。刚’．Mi8．“点篇心Stationaryexoonential exponential exD0n∞hal图4RT．PCR检测在0．25％葡萄糖LB培养基中表皮葡萄球菌不同生长期／caAB的mRNA表达Fig．4The expression of icaAB of bacterial cultivated inLB media with0．25％glucose for vary time according to the growth phraseRNAWSt8 extracted at the early—exponential(after3～4h)，mid—exponen— fial(5—6h)，post-exponential(9～10h)，and stationary(16h)pha∞8 of growth2．9葡萄糖不同的处理时间对表皮葡萄球菌97．337株生物被膜形成及生物被膜形成相关基因表达的影响在添加葡萄糖的TSB培养基中，葡萄糖作用1～6h对生物被膜诱导作用不明显，但是作用6h后泐基因的表达量较高；葡萄糖诱导生物被膜的形成是通过诱导／CaAB基因的表达，与多糖合成直接相关的基因icaAB和调控基因／CaR，agr，AtlE在葡萄糖作用不同时间的表达呈现一定的规律，葡萄糖作用6h后PIA合成直接相关的／CaA基因表达量最大，随后则逐渐降低，这与葡萄糖作用后在不同生长周期的／CaA表达基本一致，而作为／ca操纵子表达负性调控因子／CaR的表达与整个／ca操纵子的表达基本一致，说明葡萄糖对生物被膜的诱导并不通过调节／CaR基因的表达。AtlE基因的表达随着细菌生长周期的变化而发生微小变化(图5)。(B) tcaA fcaRAtlE4Time after adding glucose／hOh2h6h12h16h20h100．806。窖Q0．4 o0．20图5(A)在添加0．25％葡萄糖的TSB培养基中对不同处理时间97．337株生物被膜形成；(B)在添加0．25％葡萄糖的TSB培养基中对不同处理时间97．337株中生物被膜形成相关基因的mR．NA表达水平。并将条带量化后以不同基因与16． srRNA表达量的比值为纵坐标作图Fig．5(A)Bioflim ofS．ep／derm／d／s97—337 cultured inTSB with0．25％slueo∞in different time afterSl-eo∞stimulate；(B)Expre∞ion of gene concerning biotlm inS．epldermid／s97—337 ealtured inTSB with025％slueose after stimulated by glucose(0．25％)，and in the following graph the expression level of a gene is indicated by ratio of densitometrie value of the gene band to that of16srRNA3讨论粘附在临床上常用的多聚材料上并形成生物被膜是表皮葡萄球菌感染的必需过程，并与表皮葡萄球菌感染的慢性、持续性和反复性特点有关，因此，生物被膜形成机制的研究已成为抗表皮葡萄球菌感染研究的中心问题。表皮葡萄球菌PIA的合成是生物被膜形成的关键，PIA多糖的合成与icaADBC操纵子基因有关¨“。总糖测定的试验的结果提示，表皮葡萄球菌的糖代谢与生物被膜的形成可能有很大O●O，00OOOO000舢 ig3期靳嘉巍等：葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究435关联。葡萄糖对生物被膜形成有很强的诱导作用，葡萄糖不仅刺激了细菌的生长而且同时诱导了生物被膜的形成。葡萄糖长时作用能刺激细菌生长而对生物膜的诱导作用下降，这提示葡萄糖对生物膜的诱导除与刺激生长相关外还存在其他机制。在高浓度时葡萄糖的诱导作用反而不强可能说明生物被膜的形成与外界的渗透压有关，因为高浓度的葡萄糖可能影响了细菌生长外环境的渗透压。对细菌糖代谢的影响很大的厌氧环境诱导了生物膜的形成和增加细菌生物被膜形成对葡萄糖的敏感性进一步说明葡萄糖对生物被膜的形成的影响是通过影响细菌糖代谢。细菌的糖代谢与细菌多糖的合成和生物被膜的形成密切相关。 ic口基因编码参与是PIA合成的糖基转移酶，缸。基因是典型的原核操作子的结构，lca操作子包括调节基因IcaR和结构基因icaADBC；低生物被膜形成的表皮葡萄球菌主要由于／caA基因缺失。葡萄糖是通过直接或间接诱导糖链合成相关基因／ca基因的表达而诱导生物被膜的形成。特异性针对／ca基因反义寡核苷酸能明显抑制葡萄糖的诱导作用进一步证实葡萄糖对生物被膜的诱导作用是通过诱导／ca基因的表达。葡萄糖的诱导作用与细菌生长周期相关，葡萄糖对记口的诱导作用只在Early． exponential和Mid．exponential期，但是葡萄糖作用24h后明显诱导生物被膜的形成，推测生物被膜的形成和PIA的合成不需要泐基因的连续的表达，而且生物被膜的形成除了／ca外还需要其他的因子的表达。葡萄糖对生物被膜的诱导作用不是持续过程，葡萄糖的诱导作用在6h后对表型就有表现，而20h的诱导作用下降，可能与细菌密度依赖的agr等调节机制相关，葡萄糖对生物膜的诱导存在复杂调控机制。葡萄糖作用不同时间后，作为ica基因表达的负性调控因子的／caR的mRNA表达量的变化与 icaA基因表达并不呈现负相关，说明葡萄糖对／ca基因的调控并不是通过／caR来调控icaADBC的表达和PIA的合成，通过其他与icaR不相关的调控机制，例如通过s郸。自溶素蛋白AflE的主要功能是降解细胞壁的肽聚糖成份，AtlE定位在细胞表面通过非共价结合参与表皮葡萄球菌的向多聚材料的粘附，所以对生物膜的调控可以通过调控AtlE的表达来实现。在收集表皮葡萄球菌前2h加入葡萄糖，AtlE基因的表达量下降，推测由于这可能与AtlE参与细菌细胞壁代谢有关，因为加入葡萄糖后能刺激细菌生长。通过不同时间作用发现0．25％葡萄糖对97．337株AtlE基因表达影响不大，说明葡萄糖对生物膜形成的诱导作用主要并不是通过调节AtlE基因表达来实现的。葡萄糖对生物被膜的诱导作用主要是通过诱导／ca基因的表达和多糖PIA的合成，但对／ca基因表达的调控不是通过下调／caR的表达，而且洳基因的表达有周期性，并不持续表达，这与池表达产物为定位在细胞膜上的糖基转移酶有关；生物被膜的形成肯定需要其他基因的持续表达，而且可能与葡萄糖作用有关，但可能并非为葡萄糖调节特异性。PIA的合成是生物被膜形成的关键，葡萄糖对生物被膜的诱导作用等结果表明表皮葡萄球菌糖代谢与生物被膜形成有很密切的关系。作为条件致病菌的表皮葡萄球菌的生物被膜形成与环境密切相关，其表型的改变是通过对环境的反应调节相关基因的表达，而这是一个复杂的过程，不同的外界因素有不同的信号转导机制。参考文献[1 jVandecnsteeleSJ，PeetermansWE，MeIckxR。et a1．Expression of biofilm-associated genes inStaphylococcus epidermidis during汛 vitro 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文章来源：《生命科学仪器》 网址: http://www.smkxyq.cn/qikandaodu/2020/1224/383.html